主要试剂:
(1)1640培养基
(2)胎牛血清(FBS)
(3)Human GM-CSF
(4)Human IL-4
(5)Human TNF-a
(6)PBS
(7)青霉素-链霉素溶液(100X)
(8)DMSO
(9)台盼蓝粉末
(10)人外周血淋巴细胞分离液
主要试剂配制
(1)PBS:PBS粉剂每袋加ddH2O定容至1000mL,调pH7.2,高压灭菌,4℃保存备用。
(2)RPIM-1640培养基:临用前根据需要加15%胎牛血清,最后按1%体积分数加入双抗贮存液(青霉素+链霉素),使青霉素和链霉素的终浓度分别为100 U/mL和100 U/mL,置于4℃冰箱保存。
(3)台盼蓝染液:称取4g台盼蓝,于研钵中用少量双蒸水研磨,加双蒸水至100mL,1500rpm离心15min,吸取上层液,即为4%水溶液。用前,用1.8%氯化钠溶液稀释1倍,即为2%台盼蓝染液。
实验步骤
一、PBMC原代分离步骤
1) 抽取人的外周血于肝素抗凝管中,取足5mL新鲜血液,加入PBS按1:1稀释血液(一般采血管2mL+2mL)。
2) 取淋巴细胞分离液5mL于15mL灭菌离心管中待用。
3) 吸取稀释血液,在离分层液上方1cm处,沿试管壁徐徐加入,使稀释血液重叠于分层液上,并与分离液形成明显界面。
4) 室温,离心2000rpm,20min。此时离心管中形成5层:最上面是血浆,血浆层和淋巴细胞分离液之间是淋巴细胞层呈白膜状。
5) 小心吸取中间呈白膜状的单个核细胞层,尽量全部吸出单个核细胞。加5倍以上体积的PBS洗2次,每次离心1500rpm,10min。
6) 去上清液,加入1640培养基1mL混匀,取少量进行细胞计数。
7) 用台盼蓝染液检查所分离的细胞活性:取2滴细胞悬液加1滴2%台盼蓝染液,5-10min后取样作湿片高倍镜检。活细胞不着色,死细胞染成蓝色。计数200个细胞,计算活细胞百分率,活性应在95%以上。
二、DC细胞诱导
1) 将收集的PBMC在1640培养基,在37 ℃、5 % CO2条件下在培养板培养4h。
2) 轻轻吸取上清,收集贴壁细胞,加入含15%血清,100ng/ml rhGM-CSF、100ng/ml rhIL-4的1640培养基,培养5~7d获得未成熟DC,用25ng/ml hTNF-α刺激2~3天,获得成熟DC。
3) 用倒置显微镜观察细胞形态,至细胞毛刺样突起,有典型DC形态悬浮细胞。
三、注意事项:
细胞最好在细胞贴壁注:分离后细胞最好在贴壁后当天换液(贴壁细胞贴壁能力很弱,润洗时轻柔),过夜后部分细胞漂浮,细胞得率减少。